IPTG (იზოპროპილ-β-D-თიოგალაქტოზიდი) β-გალაქტოზიდაზას სუბსტრატის ანალოგია, რომელიც მაღალი ინდუცირებადობით ხასიათდება. IPTG-ს ინდუქციის დროს ინდუქტორს შეუძლია კომპლექსის წარმოქმნა რეპრესორულ ცილასთან, რის შედეგადაც რეპრესორული ცილის კონფორმაცია იცვლება, ისე, რომ ის ვერ შეერთდება სამიზნე გენთან და სამიზნე გენი ეფექტურად ექსპრესირდება. მაშ, როგორ უნდა განისაზღვროს IPTG-ს კონცენტრაცია ექსპერიმენტის დროს? რაც უფრო დიდია, მით უკეთესი?
პირველ რიგში, მოდით გავიგოთ IPTG ინდუქციის პრინციპი: E. coli-ს ლაქტოზას ოპერონი (ელემენტი) შეიცავს სამ სტრუქტურულ გენს, Z, Y და A, რომლებიც შესაბამისად აკოდირებენ β-გალაქტოზიდაზას, პერმეაზას და აცეტილტრანსფერაზას. lacZ ჰიდროლიზებს ლაქტოზას გლუკოზად და გალაქტოზად, ან ალოლაქტოზად; lacY საშუალებას აძლევს გარემოში არსებულ ლაქტოზას გაიაროს უჯრედის მემბრანა და შევიდეს უჯრედში; lacA გადასცემს აცეტილის ჯგუფს აცეტილ-CoA-დან β-გალაქტოზიდზე, რაც გულისხმობს ტოქსიკური ეფექტის მოხსნას. გარდა ამისა, არსებობს ოპერაციული თანმიმდევრობა O, საწყისი თანმიმდევრობა P და მარეგულირებელი გენი I. I გენის კოდი არის რეპრესორული ცილა, რომელსაც შეუძლია დაუკავშირდეს ოპერატორის თანმიმდევრობის O პოზიციას, ისე, რომ ოპერონი (მეტა) რეპრესირებული და გამორთულია. ასევე არსებობს კატაბოლური გენის აქტივატორი ცილის - CAP შეკავშირების ადგილის შეკავშირების ადგილი საწყისი თანმიმდევრობის P-ს ზემოთ. P თანმიმდევრობა, O თანმიმდევრობა და CAP შეკავშირების ადგილი ერთად ქმნიან lac ოპერონის მარეგულირებელ რეგიონს. სამი ფერმენტის კოდირების გენები რეგულირდება ერთი და იგივე მარეგულირებელი რეგიონით, რათა მიღწეულ იქნას გენური პროდუქტების კოორდინირებული ექსპრესია.
ლაქტოზის არარსებობის შემთხვევაში, lac ოპერონი (მეტა) რეპრესიის მდგომარეობაშია. ამ დროს, I თანმიმდევრობით გამოხატული lac რეპრესორი, PI პრომოტორის თანმიმდევრობის კონტროლის ქვეშ, უკავშირდება O თანმიმდევრობას, რაც ხელს უშლის რნმ პოლიმერაზას P თანმიმდევრობასთან დაკავშირებას და აფერხებს ტრანსკრიფციის დაწყებას; როდესაც ლაქტოზა არსებობს, lac ოპერონის (მეტა) ინდუცირება შესაძლებელია. ამ ოპერონულ (მეტა) სისტემაში რეალური ინდუქტორი თავად ლაქტოზა არ არის. ლაქტოზა შედის უჯრედში და კატალიზდება β-გალაქტოზიდაზას მიერ ალოლაქტოზად გარდასაქმნელად. ეს უკანასკნელი, როგორც ინდუქტორის მოლეკულა, უკავშირდება რეპრესორულ ცილას და ცვლის ცილის კონფორმაციას, რაც იწვევს რეპრესორული ცილის დისოციაციას O თანმიმდევრობიდან და ტრანსკრიფციიდან. იზოპროპილთიოგალაქტოზიდს (IPTG) აქვს იგივე ეფექტი, რაც ალოლაქტოზას. ის ძალიან ძლიერი ინდუქტორია, რომელიც არ მეტაბოლიზდება ბაქტერიების მიერ და ძალიან სტაბილურია, ამიტომ ფართოდ გამოიყენება ლაბორატორიებში.
როგორ განვსაზღვროთ IPTG-ის ოპტიმალური კონცენტრაცია? მაგალითად ავიღოთ E. coli.
E. coli BL21 გენმოდიფიცირებული შტამი, რომელიც შეიცავდა დადებით რეკომბინანტულ pGEX-ს (CGRP/msCT), ინოკულირებული იქნა LB თხევად გარემოში, რომელიც შეიცავდა 50μg·mL-1 ამპერს და კულტივირებული იქნა მთელი ღამის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე. ზემოაღნიშნული კულტურა ინოკულირებული იქნა 10 ბოთლში, რომელიც შეიცავდა 50მგ·mL-1 ამპერს, 1:100 თანაფარდობით გაფართოების კულტურისთვის და როდესაც OD600 მნიშვნელობა იყო 0.6~0.8, საბოლოო კონცენტრაციას დაემატა IPTG. ის არის 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 მმოლ·L-1. იმავე ტემპერატურაზე და იმავე დროს ინდუქციის შემდეგ, მისგან აღებული იქნა ბაქტერიული ხსნარის 1 მლ, ბაქტერიული უჯრედები შეგროვდა ცენტრიფუგირებით და დაექვემდებარა SDS-PAGE-ს, რათა გაანალიზებულიყო სხვადასხვა IPTG კონცენტრაციის გავლენა ცილის ექსპრესიაზე, შემდეგ კი შეირჩა IPTG კონცენტრაცია ყველაზე დიდი ცილის ექსპრესიით.
ექსპერიმენტების შემდეგ აღმოჩნდება, რომ IPTG-ს კონცენტრაცია რაც შეიძლება დიდი არ არის. ეს იმიტომ ხდება, რომ IPTG-ს გარკვეული ტოქსიკურობა აქვს ბაქტერიების მიმართ. კონცენტრაციის გადაჭარბება ასევე კლავს უჯრედს; და ზოგადად, ვიმედოვნებთ, რომ რაც უფრო მეტი ხსნადი ცილა იქნება გამოხატული უჯრედში, მით უკეთესი, მაგრამ ბევრ შემთხვევაში, როდესაც IPTG-ს კონცენტრაცია ძალიან მაღალია, დიდი რაოდენობით ჩანართი წარმოიქმნება. ორგანიზმში ხსნადი ცილის რაოდენობა მცირდება. ამიტომ, ყველაზე შესაფერისი IPTG კონცენტრაცია ხშირად არა რაც უფრო დიდია, მით უკეთესი, არამედ რაც უფრო დაბალია კონცენტრაცია.
გენმოდიფიცირებული შტამების ინდუქციისა და კულტივაციის მიზანია სამიზნე ცილის მოსავლიანობის გაზრდა და ხარჯების შემცირება. სამიზნე გენის ექსპრესიაზე გავლენას ახდენს არა მხოლოდ შტამის საკუთარი ფაქტორები და ექსპრესიის პლაზმიდი, არამედ სხვა გარე პირობებიც, როგორიცაა ინდუქტორის კონცენტრაცია, ინდუქციის ტემპერატურა და ინდუქციის დრო. ამიტომ, ზოგადად, უცნობი ცილის ექსპრესიასა და გაწმენდამდე, საუკეთესოა ინდუქციის დროის, ტემპერატურისა და IPTG კონცენტრაციის შესწავლა, რათა შერჩეს შესაბამისი პირობები და მივიღოთ საუკეთესო ექსპერიმენტული შედეგები.
გამოქვეყნების დრო: 2021 წლის 31 დეკემბერი